Die transkriptomische Uhr sagt Gefäßveränderungen bei prodromaler diabetischer Retinopathie voraus

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12968 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Diabetische Retinopathie ist eine häufige Komplikation von Langzeitdiabetes und kann zu Sehverlust führen. Leider ist die frühe diabetische Retinopathie noch immer kaum erforscht. Es gibt keine wirksame Möglichkeit, eine frühe diabetische Retinopathie zu verhindern oder zu behandeln, bis die Patienten spätere Stadien der diabetischen Retinopathie entwickeln. Eine erhöhte azelluläre Kapillardichte gilt als zuverlässiges quantitatives Merkmal in der frühen Entwicklung einer Retinopathie. Daher haben wir in dieser Studie die transkriptomischen Veränderungen der gesamten Netzhautgefäße mithilfe eines Nilrattenmodells untersucht, um die frühe Pathogenese der diabetischen Retinopathie besser zu verstehen. Wir haben die Komplexität der Zusammenhänge zwischen der azellulären Kapillardichte und den gemeinsamen Faktoren Blutzucker, Ernährung und Geschlecht aufgedeckt, die mithilfe eines Bayes'schen Netzwerks modelliert wurden. Mithilfe segmentierter Regressionen haben wir verschiedene Genexpressionsmuster identifiziert und die Begriffe der Genontologie (GO) angereichert, die mit der Zunahme der azellulären Kapillardichte verbunden sind. Wir haben ein Random-Forest-Regressionsmodell entwickelt, das auf Expressionsmustern von 14 Genen basiert, um die azelluläre Kapillardichte vorherzusagen. Da die azelluläre Kapillardichte ein zuverlässiges quantitatives Merkmal bei der frühen diabetischen Retinopathie ist, kann unser Modell als transkriptomische Uhr zur Messung der Schwere des Fortschreitens der frühen Retinopathie verwendet werden. Wir identifizierten außerdem NVP-TAE684, Geldanamycin und NVP-AUY922 als die drei potenziellen Medikamente, die die frühe DR möglicherweise abschwächen können. Obwohl wir in Zukunft weitere In-vivo-Studien benötigen, um unsere zweckentfremdeten Arzneimittel zu unterstützen, haben wir einen datengesteuerten Ansatz für die Arzneimittelentwicklung bereitgestellt.

Diabetische Retinopathie ist eine häufige Diabetes-Komplikation bei Langzeitdiabetes, die zu einer Schädigung der Netzhautblutgefäße führt und zu Sehverlust führen kann. In mehreren Industrieländern, darunter den Vereinigten Staaten, ist die diabetische Retinopathie die häufigste Ursache für neue Fälle von Blindheit bei Erwachsenen im Alter von 20 bis 741 Jahren. Menschen mit Diabetes haben unabhängig von den klinischen Subtypen ein etwa ein Drittel erhöhtes Risiko, eine diabetische Retinopathie zu entwickeln2 , was sowohl Männer als auch Frauen im Allgemeinen gleichermaßen betrifft3,4.

Im Frühstadium kann eine nicht-proliferative diabetische Retinopathie (DR) durch Screening erkannt werden, wenn das Sehvermögen noch nicht beeinträchtigt ist. Es gibt jedoch keine wirksame Möglichkeit, das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, um einem Sehverlust vorzubeugen, weshalb Patienten häufig bis in spätere Stadien unbehandelt bleiben. Darüber hinaus ist die diabetische Retinopathie nicht reversibel und schreitet weiter voran. In einigen Fällen entwickelt sich schließlich eine proliferative diabetische Retinopathie, bei der sich eine Fibrose auf der Netzhautoberfläche entwickelt und abnormale, zu Blutungen neigende neue Gefäße zu einem Sehverlust führen5. Um einen Sehverlust durch diabetische Retinopathie zu verhindern, müssen wir die frühe Pathogenese der asymptomatischen Retinopathie verstehen. Leider sind diese frühen Prozesse noch immer kaum verstanden, was zum Teil auf unzureichendes histologisches Material von menschlichen Spendern und begrenzte Tiermodelle zurückzuführen ist, die den natürlichen Verlauf der diabetischen Retinopathie beim Menschen rekapitulieren können6.

Die in Nordafrika beheimatete Nilratte (Arvicanthis niloticus) ist ein tagaktives Nagetier, dessen Nahrung hauptsächlich aus Grashalmen besteht7. Wenn die Nilratte jedoch in einer Laborumgebung mit herkömmlichem Nagetierfutter gefüttert wird, entwickelt sie bei beiden Geschlechtern schnell einen ernährungsbedingten Diabetes. Zur Verdeutlichung: Herkömmliches Nagetierfutter ist zwar dazu gedacht, die Gesundheit gewöhnlicher Labornagetiere zu ernähren, ist jedoch im Vergleich zur einheimischen Ernährung der Nilrattenart hyperkalorisch und wird im Folgenden als kalorienreiche Ernährung beschrieben. Um ernährungsbedingtem Diabetes in einer Laborumgebung vorzubeugen, kann die Nilratte mit einer ballaststoffreichen Diät gefüttert werden8. Somit scheint der ernährungsbedingte Diabetes bei der Nilratte dem natürlichen Verlauf des Typ-2-Diabetes beim Menschen zu folgen. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass diabetische Nilratten eine Retinopathie mit fortgeschrittenen Netzhautläsionen entwickeln können, die den klinischen Merkmalen ähneln, die mit Sehverlust beim Menschen verbunden sind, wie Makulaödem, kapilläre Nichtdurchblutung und proliferative diabetische Retinopathie9. Zu den Läsionen bei Nilratten gehörten insbesondere Netzhautleckage, Netzhautverdickung, kapillare Nichtdurchblutung, intraretinale mikrovaskuläre Anomalien und scheinbar proliferative diabetische Retinopathie, basierend auf der beobachteten Neovaskularisation über die Netzhautoberfläche hinaus9. Typischerweise weisen andere Nagetiermodelle mit ernährungsbedingter diabetischer Retinopathie nicht die exakten mikrovaskulären Schäden auf, die beim Menschen beobachtet werden, und weisen häufig keine proliferative Neovaskularisation auf. Allerdings wurde eine Neovaskularisation bei relativ älteren Nilratten beobachtet und das Alter könnte eine Rolle bei der Neovaskularisation spielen. In dieser Studie haben wir auch gezeigt, dass eine erhöhte azelluläre Kapillardichte ein zuverlässiges quantitatives Merkmal ist, das bei der anfänglichen Entwicklung einer Retinopathie vorhanden ist und einer zusätzlichen Gefäßdysfunktion in Perizyten und Endothelzellen vorausgeht9. Die Verwendung der azellulären Kapillardichte der Netzhaut als einer der frühesten Marker für Retinopathie ist sowohl bei Nilratten9 als auch beim Menschen10 konsistent. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die Veränderung des Netzhautgefäßsystems ein wichtiger ursächlicher Faktor für die Auslösung und Förderung der Pathogenese der diabetischen Retinopathie ist. Da die azelluläre Kapillardichte der Netzhaut eine der ersten nachweisbaren Veränderungen ist, die für eine vaskuläre Dysfunktion der Netzhaut relevant sind, könnten wir die azelluläre Kapillardichte verwenden, um das frühe Fortschreiten der Erkrankung bei diabetischer Retinopathie zu markieren.

In dieser Studie suchen wir nach Gensignaturen, die dem Fortschreiten der zunehmenden azellulären Kapillardichte im Gefäßnetzwerk der gesamten Netzhaut entsprechen. Wir führten RNA-Seq an frisch isoliertem Netzhautgefäßgewebe von 28 männlichen und weiblichen Nilratten durch, die entweder eine kalorienreiche oder ballaststoffreiche Diät erhielten. Aus unserer vorherigen Studie wussten wir, dass die azelluläre Kapillardichte ein bilateraler Phänotyp ist, bei dem das linke und das rechte Auge bei einzelnen Nilratten stark korrelieren9. Unter Ausnutzung der bilateralen Natur dieses Phänotyps könnten wir ein Auge verwenden, um die azelluläre Kapillardichte zu bestimmen, die fixiertes Gewebe erfordert, und das kontralaterale Auge, um frisches Gewebe für die RNA-Sequenzierung zu entnehmen. Wir identifizierten Gensignaturen, die mit einer zunehmenden azellulären Kapillardichte verbunden sind, einem quantitativen Marker für eine frühe Retinopathie. Mithilfe eines Random-Forest-Modells für maschinelles Lernen identifizierten wir eine Kombination von vierzehn Genen, die die azelluläre Kapillardichte quantitativ vorhersagen können, die als gefäßspezifische transkriptomische Uhr dienen kann, die das Fortschreiten der Retinopathie anzeigt.

Unter Nutzung einer umfangreichen Signaturdatenbank für gestörte Genexpression chemischer Verbindungen/Arzneimittel (LINCS L1000) haben wir NVP-TAE684, Geldanamycin und NVP-AUY922 als die drei wichtigsten potenziellen Arzneimittel identifiziert, die die mit der azellulären Kapillardichte korrelierten Gensignaturen umkehren und so bereitstellen können mutmaßliche Medikamentenkandidaten zur Behandlung der frühen Stadien der Retinopathie. Interessanterweise sind sowohl Geldanamycin als auch NVP-AUY922 Hsp90-Inhibitoren11,12. Studien haben gezeigt, dass Hsp90-Inhibitoren eine Netzhautdegeneration in Modellen für Retinitis pigmentosa und altersbedingte Makuladegeneration verhindern können13. Obwohl unsere zweckentfremdeten Arzneimittelkandidaten einer weiteren Validierung in vivo bedürfen, haben wir einen neuartigen datengesteuerten Ansatz zur Priorisierung von Verbindungen bereitgestellt, die möglicherweise das Fortschreiten der Retinopathie vor einer dauerhaften Sehbehinderung blockieren können. Unsere Studie deckt auch die Transkriptomik der Netzhautgefäße auf, die mit der frühen Pathogenese der Retinopathie in Zusammenhang steht.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California Santa Barbara genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt; Studienprotokoll 893. UCSB-Gründer-Nilratten wurden aus der Brandeis University-Kolonie des KC Hayes Laboratory abgeleitet. Nilratten in UCSB werden in einem Raum mit 12-stündigem Lichtzyklus (10 bis 22 Uhr) bei 21–26 °C in einer konventionellen Anlage mit individuell belüfteten Käfigen gehalten und erhalten autoklavierte Sanichips als Einstreumaterial, einschließlich zusätzlicher Käfiganreicherung Holzklötze und Plastikknochen. Den diabetischen Ratten wurde kein Insulin verabreicht. Um schwerwiegende Nebenwirkungen durch Diabetes zu vermeiden, haben wir alle Tiere eingeschläfert, die einen Gewichtsverlust von über 5 % oder einen starken Abfall des RBG von über 100 mg/dl aufwiesen. Um diese Tiere zu identifizieren, überprüfen wir wöchentlich das Gewicht und den RBG aller Nilratten, nachdem sie einen RBG ≥ 500 mg/dL erreicht haben.

Nilratten erhalten entweder eine ballaststoffreiche Diät (Lab Diet 5L3M; Newco Speciality, Rancho Cucamonga, CA, USA) oder eine kalorienreiche Diät (Formulab Diet 5008; Newco Speciality, Rancho Cucamonga, CA, USA)14. Der Rohfaseranteil beträgt bei der ballaststoffreichen Ernährung 23 %, bei der kalorienreichen Ernährung nur 4 %. Das Verhältnis des Kalorienanteils aus Kohlenhydraten, Fett und Protein betrug 67:10:23 für die ballaststoffreiche Ernährung und 56:17:27 für die kalorienreiche Ernährung. Der zufällige Blutzuckerspiegel (RBG) wird mit einem Glukometer (Contour) alle vier Wochen (zwischen 14 und 17 Uhr) gemessen, beginnend im Entwöhnungsalter (im Alter von 4 Wochen) mit Blut aus einer Schwanzpunktion. An dieser Studie waren insgesamt 32 Nilratten beteiligt. Vier von zweiunddreißig Nilrattenproben versagten beim Schritt der RNA-seq-Bibliothek (gesamtes Netzhautgefäßsystem). Somit haben wir insgesamt 28 Nilratten für die RNA-seq-Datenanalyse. Die detaillierten Nilratteninformationen, wie azelluläre Kapillardichte, durchschnittlicher zufälliger Blutzucker, Dauer des Diabetes, Geschlecht, Alter, Ernährung und ob sie in die RNA-seq-Datenanalyse einbezogen werden, sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Alle Tiere sind Wir werden die Anwendung auf Anzeichen der Entwicklung von diabetischen Komplikationen überwachen, die als belastend für das Tier angesehen werden könnten, darunter unter anderem Dehydrierung (schwere Polydipsie und Polyurie, ein Hinweis auf Nierenversagen) oder ausgeprägte und anhaltende Schwäche oder Lethargie der humane Endpunkt für diese notleidenden Tiere. Sterbehilfe wird durch Kohlendioxid-Inhalation durchgeführt. Die Berichterstattung über diese Studie erfolgt in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org).

Bei jedem Tier führten wir einen Trypsinverdau auf einer Netzhaut durch und sammelten das Netzhautgefäßsystem für RNA-Seq von der anderen Netzhaut. Das Netzhautgefäßsystem wurde durch osmotische Lyse von anderen Netzhautzellen gelöst, wobei die Netzhaut 1 Stunde lang in RNase-freies Wasser bei 4 °C auf einem Schüttler gegeben wurde. Anschließend wurde Wasser abgesaugt und das verbleibende Netzhautgewebe 15 Minuten lang in einer 10 %igen DNase-Lösung bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Netzhaut mit RNase-freiem Wasser in eine Petrischale überführt. Unter einem Präpariermikroskop spritzten wir mit einer P200-Pipette Wasser auf die Netzhaut, bis sich die innere Grenzmembran löste und neuronale Zellen aus dem Netzhautgefäßsystem weggespült wurden. Schließlich wird das resultierende Netzhautgefäßsystem über Nacht bei 4 °C in RNAlater konserviert und bei –80 °C gelagert. Für den Trypsinverdau verwendeten wir unsere zuvor veröffentlichte Methode9.

Gesamt-RNAs aus 32 Gefäßproben von Nilratten wurden unter Verwendung von Trizol (ThermoFisher Nr. 15596018) und Chloroform-Phasentrennungen isoliert, gefolgt vom RNeasy Mini-Protokoll (Qiagen Nr. 74106) mit optionalem DNase-Verdau auf der Säule (Qiagen Nr. 79254). Einhundert Nanogramm Gesamt-RNA wurden zur Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken unter Verwendung des LM-Seq-Protokolls (Ligation Mediated Sequencing)15 verwendet. Die RNAs wurden mit dem NEB Next Poly A + Isolation Kit (NEB #E7490S/L) ausgewählt. Poly A+-Fraktionen wurden eluiert, geprimt und 7 Minuten lang bei 85 °C fragmentiert. Die erste cDNA-Synthese wurde mit SmartScribe Reverse Transcriptase (Takara Bio USA #639538) durchgeführt und die RNA entfernt. cDNA-Fragmente wurden mit AMpure XP-Kügelchen (Beckman Coulter #A63881) gereinigt. Der 5'-Adapter wurde ligiert und es wurden 18 Amplifikationszyklen durchgeführt. Diese endgültigen indizierten cDNA-Bibliotheken wurden quantifiziert, normalisiert, gemultiplext und als Single-End-Reads auf dem HiSeq 3000-Sequenzer ausgeführt. Vier von zweiunddreißig RNA-seq-Proben von Nilratten scheiterten während des Bibliotheksvorbereitungsschritts und wurden daher in der RNA-seq-Datenanalyse ausgeschlossen. Daher gibt es in der nachgelagerten Datenanalyse 28 Nilratten-RNA-seq-Proben.

Wir haben unser im Labor entwickeltes CRSP-Tool16 verwendet, um die Genexpressionswerte des Gefäßgewebes der Netzhaut von Nilratten abzuschätzen. Insbesondere wurden die RNA-Seq-Reads der Netzhautgefäße auf in unserem Labor vorgefertigte transkriptomische Contigs von Nilratten abgebildet, die mit dem Trinity-Tool17 auf der Grundlage einer ultratiefen Sequenzierung (2,3 Milliarden × 2 Paired-End-Reads) von 22 gepoolten Hauptorganen von Nilratten16 zusammengestellt wurden . Die transkriptomischen Contigs wurden basierend auf Mausproteinen über das NCBI BLASTX-Tool18 mit einem E-Wert <10–5 annotiert. Eine Abundanzschätzung auf Contig-Ebene wird über RSEM19 durchgeführt. Für jede vaskuläre RNA-Seq-Probe der Netzhaut von Nilgrasratten werden RNA-Seq-kartierte Lesezahlen auf Genebene ermittelt, indem die Zählungen der Contigs summiert werden, die Proteinen mit demselben Gensymbol zugeordnet sind. Die relativen Häufigkeiten, ausgedrückt in Transkripten pro Million (TPM), für Gene wurden berechnet, indem zunächst die Fragmentanzahl jedes Gens durch die Summe der „effektiven Längen“ (Länge abzüglich der Leselänge) der diesem Gen zugeordneten Contigs normalisiert wurde und dann Skalieren Sie die resultierenden Werte so, dass sie über alle Gene hinweg eine Million ergeben. Die TPM-Werte wurden über die Median-of-Ratio-Methode des EBSeq20 R-Pakets weiter normalisiert.

Mikroaufnahmen zur Quantifizierung wurden mit einer Canon Rebel XSi-Digitalkamera (Canon, Tokio, Japan) aufgenommen, die über eine LM-Oszilloskop-C-Halterung an ein Olympus CKX41-Mikroskop angeschlossen war. Zur Zählung der azellulären Kapillaren wurden 12 mikroskopische Aufnahmen aus 3 zufällig ausgewählten Bereichen in jedem der 4 Netzhautquadranten gemacht und bei einer Endvergrößerung von 200fach analysiert. Wir haben abnormale Kapillarmerkmale in drei Gruppen eingeteilt: Die erste Gruppe besteht aus definitiven azellulären Kapillaren; Die zweite Gruppe sind Perizytenprozesse (beschrieben in unserer Arbeit9) und die dritte Gruppe sind mehrdeutige abnormale Merkmale, die sehr kurz waren oder manchmal teilweise von anderen Gefäßen verdeckt wurden. Die zur Quantifizierung verwendete Gesamtfläche entsprach etwa 8,5 % der gesamten Netzhautfläche. Die Zählungen wurden mithilfe der FIJI-Computersoftware ohne zusätzliche Plugins von zwei maskierten Bewertern quantifiziert.

Um Genexpressionsmuster zu erkennen, die mit azellulären Kapillardichteniveaus verbunden sind, führten wir eine segmentierte Regressionsanalyse durch. Die segmentierte Regression ist eine Methode, bei der die unabhängige Variable in Intervalle und eine separate lineare Regression unterteilt wird, um sie an jedes Intervall anzupassen. Für jedes Gen wurde die Anzahl der Haltepunkte durch das niedrigste Bayes'sche Informationskriterium (BIC)21 bestimmt, indem alle K (K < = N) einer möglichen Anzahl von Haltepunkten aufgezählt wurden, wobei N die Anzahl der Zeitpunkte war. Für jedes Gen wird ein optimales Modell gefunden. Wir haben die Anpassungsgüte des optimalen Modells weiter als angepassten Korrelationskoeffizienten R2 definiert:

Dabei ist das optimal gewählte K für ein bestimmtes Gen und N die Anzahl der Zeitpunkte. Um die Falscherkennungsrate (FDR) weiter abzuschätzen, haben wir die Daten permutiert und die Hintergrundverteilung von R2 bewertet. Wir betrachten nur Gene mit einem FDR < 5 % als gut passend. Die segmentierte Regression wurde durch das Trendy22 R-Paket implementiert.

Die Anreicherungsanalyse der Genontologie (GO) wurde mit dem R-Paket („allez“)23 durchgeführt. Die Anreicherungs-p-Werte wurden durch mehrfache Testkorrektur nach Benjamini-Hochberg (BH) weiter angepasst.

Wir verwendeten das Random Forest Regression (RFR)-Modell, um die azelluläre Kapillardichte der Netzhaut anhand von Genexpressionsmustern vorherzusagen. RFR ist ein überwachter Algorithmus für maschinelles Lernen, der eine Ensemble-Lernmethode für die Regression verwendet. Die Ensemble-Lernmethode ist eine Technik, die Vorhersagen mehrerer maschineller Lernmodelle kombiniert, um eine genauere Vorhersage als ein einzelnes Modell zu treffen. RFR erstellt zur Trainingszeit eine Vielzahl von Entscheidungsbäumen. Es nutzt zwei Techniken des maschinellen Lernens: Bagging24 und zufällige Funktionsauswahl. Beim Bagging wird jeder Baum anhand einer Bootstrap-Stichprobe der Trainingsdaten trainiert, und durch die Aggregation der Vorhersageergebnisse werden Vorhersagen anhand der Bäume getroffen. RFR wählt beim Wachsen eines Baums zufällig eine Teilmenge von Features aus, die an jedem Knoten geteilt werden sollen. Um die Vorhersageleistung des Random-Forest-Algorithmus zu bewerten, führt RFR parallel zum Trainingsschritt eine Art Kreuzvalidierung durch, indem er die sogenannten Out-of-Bag (OOB)-Stichproben verwendet. Konkret wird jeder Baum im Training mit einem bestimmten Bootstrap-Beispiel gezüchtet. Da es sich beim Bootstrapping um eine Stichprobe mit Ersetzung aus den Trainingsdaten handelt, werden einige Sequenzen aus der Stichprobe „weggelassen“, während andere in der Stichprobe wiederholt werden. Die „ausgelassenen“ Sequenzen bilden die OOB-Stichprobe. Im Durchschnitt wird jeder Baum mit etwa 1 − e−1 ≅ 2/3 der Trainingssequenzen gezüchtet, sodass e−1 ≅ 1/3 als OOB verbleibt. Da bei der Baumkonstruktion keine OOB-Sequenzen verwendet wurden, kann man sie zur Schätzung der Vorhersageleistung verwenden25. Der RF-Algorithmus wurde durch das R-Paket „randomForest“26 implementiert. Wir haben zunächst die Genbedeutung anhand des Permutationstests eingestuft, um mit einer minimalen Anzahl von Genen die beste Vorhersageleistung zu erzielen. Insbesondere haben wir die Expressionsmuster jedes Gens permutiert und die Vorhersagefehleränderungen für jede Permutation berechnet. Wenn ein Gen essentiell ist, führt die Permutation intuitiv zu einer erheblichen Verringerung der Vorhersageleistung. Daher können wir die Genbedeutung basierend auf den Vorhersagefehleränderungen für jede Permutation einstufen. Anschließend verwendeten wir eine Vorwärts-Feature-Selektionsmethode (d. h. das Hinzufügen jedes Gens nach dem anderen, beginnend mit den drei wichtigsten Genen), um eine Mindestanzahl von Genen auszuwählen, die die beste Leistung erzielen können. Die Vorhersageleistung wurde anhand des Pearson-Korrelationskoeffizienten (R) zwischen beobachteten und vorhergesagten azellulären Kapillardichten berechnet. Wir haben festgestellt, dass durch die Kombination der 14 besten Gene der beste Pearson-Korrelationskoeffizient (R) erzielt wurde. Daher haben wir die Genexpressionsmuster der 14 am besten bewerteten Gene als Merkmale verwendet, um ein RFR-Modell zur Vorhersage der azellulären Kapillardichte zu erstellen.

Eine erhöhte azelluläre Kapillardichte ist eines der frühesten erkennbaren Anzeichen einer diabetischen Retinopathie9,10. Azelluläre Kapillaren sind Kapillarsegmente ohne Kerne entlang ihrer Länge, wie in Abb. 1 dargestellt (azelluläre Kapillaren der Netzhaut der Nilratte; als Pfeile angezeigt). Hyperglykämie ist ein bekannter Risikofaktor für eine Vergrößerung der azellulären Kapillaren9,10. Es ist jedoch unklar, wie die azelluläre Kapillardichte mit drei relevanten Faktoren von Typ-2-Diabetes zusammenhängt: Blutzuckerspiegel, Ernährung und Geschlecht. Zunächst führten wir eine Rangkorrelationsanalyse nach Spearman durch (N = 32; Nilratten; siehe Ergänzungstabelle 1), um die Korrelation zwischen dem zufälligen Blutzuckerspiegel (RBG) und der azellulären Kapillardichte zu untersuchen. Wie in Abb. 2A gezeigt, ist das RBG mäßig mit der azellulären Kapillardichte assoziiert (Spearman-Korrelationskoeffizient Rho = 0,31, P-Wert = 0,09), was auf eine positive, aber komplexe Beziehung zwischen RBG und azellulärer Kapillardichte hinweist, bei der der Trend offensichtlicher ist im prädiabetischen Bereich von RBG. Wir haben auch beobachtet, dass einige Nilratten mit hoher azellulärer Kapillardichte keine Hyperglykämie haben. Als nächstes untersuchten wir die Rolle der Ernährung. Nilratten, die eine kalorienreiche Ernährung erhielten, haben im Vergleich zu Nilratten, die eine ballaststoffreiche Ernährung erhielten, einen höheren RBG (Abb. 2B, exakter Wilcoxon-Rangsummentest, P-Wert = 1,38e-05). In unserer Studienkohorte hatten 61,9 % der Nilratten, die eine kalorienreiche Diät erhielten, noch keine Hyperglykämie entwickelt, definiert als RBG > 100 mg/dl9. Daher könnten wir untersuchen, ob die Ernährung die azelluläre Kapillardichte unabhängig von RBG beeinflussen kann. Da es bei der Retinopathie außerdem Unterschiede zwischen Männern und Frauen geben kann, haben wir auch das Geschlecht in unsere Analyse der azellulären Kapillardichte einbezogen. Um einzelne Faktoren zu verstehen, die zu einer erhöhten azellulären Kapillardichte beitragen, haben wir ein Bayesianisches Netzwerk (BN) entwickelt, um die bedingte Wahrscheinlichkeit einer hohen azellulären Kapillardichte basierend auf RBG, Ernährung und Geschlecht zu berechnen. Wie in Abb. 2C dargestellt, steigt die Wahrscheinlichkeit einer hohen azellulären Kapillardichte zunehmend, wenn Faktoren wie Blutzuckerspiegel, Ernährung und Geschlecht kombiniert werden. Beispielsweise besteht bei einer Nilratte, die sich kalorienreich ernährt, eine Wahrscheinlichkeit von 43,07 %, eine azelluläre Kapillardichte von mehr als 10 Zählungen pro mm2 zu entwickeln. Diese Wahrscheinlichkeit erhöht sich auf 62,0 %, wenn diese Nilratte ebenfalls einen RBG > 100 mg/dL aufweist. Wenn diese Nilratte außerdem männlich ist, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit weiter auf 80,56 %. Daher besteht bei einer männlichen Nilratte, die sich kalorienreich ernährt und einen hohen Blutzuckerspiegel hat, eine viel höhere Wahrscheinlichkeit, eine hohe azelluläre Kapillardichte aufzuweisen, ein quantitativer Marker für eine frühe Retinopathie.

Demonstration der azellulären Kapillaren der Netzhaut von Nilratten und des gesamten experimentellen Designs für RNA-seq. Pfeile zeigen azelluläre Kapillaren. Azelluläre Kapillaren sind kapillargroße Gefäßröhren ohne Kerne, die als Schlüsselsymptom im Frühstadium einer Retinopathie gelten.

Faktoren, die mit einer erhöhten azellulären Kapillardichte (ACD) verbunden sind. (A) Zufälliger Blutzucker (RBG) ist mäßig mit ACD assoziiert (Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman Rho = 0,31, P-Wert = 0,09); (B) Eine kalorienreiche Ernährung ist signifikant mit einem hohen zufälligen Blutzucker (RBG) verbunden (exakter Wilcoxon-Rangsummentest, P-Wert = 1,38e-05); (C) Das Bayes'sche Netzwerk, das die bedingte Wahrscheinlichkeit einer relativ höheren ACD (> 10 Zählungen pro mm2) modelliert, legt nahe, dass die kombinierten Faktoren hoher RBG, kalorienreiche Ernährung und Mann zu einer doppelt so hohen Wahrscheinlichkeit einer hohen ACD führen als alle anderen Faktoren allein.

Wir stellten die Hypothese auf, dass das Netzhautgefäßsystem molekulare Signale enthält, die die frühen Stadien der Pathogenese der Retinopathie steuern. Um unsere Hypothese zu testen, führten wir eine RNA-Seq an diesen gesamten Netzhautgefäßgeweben (siehe Methoden) von Nilratten durch. Wir haben insgesamt 32 Nilratten mit einem großen dynamischen Bereich der azellulären Kapillardichte von 2,9 bis 17,9 (Median: ~ 10) Zählungen pro mm2. Allerdings bestanden vier Nilrattenproben die Qualitätskontrolle (QC) während des RNA-seq-Bibliotheksschritts nicht und wurden daher von der RNA-seq-Datenanalyse ausgeschlossen (Ergänzungstabelle 1). Daher gibt es insgesamt 28 Daten zur vaskulären RNA-Sequenz der Netzhaut von Nilratten. Die Genexpressionswerte der Netzhautgefäße wurden als normalisierte TPM-Werte (Transkript pro Million) quantifiziert. Wir führten eine segmentierte Regressionsanalyse durch, um Gensignaturen zu identifizieren, die mit einer erhöhten azellulären Kapillardichte verbunden sind (siehe Methoden). Wie in Abb. 3 gezeigt, haben wir vier Hauptkategorien der Genexpressionsmuster identifiziert, die mit einer erhöhten ACD verbunden sind: Up (Genexpression hochreguliert); Down (Genexpression herunterreguliert); Up-Down (die Genexpression steigt zuerst an und wird dann herunterreguliert); Down-Up (die Genexpression nimmt zunächst ab und wird dann hochreguliert). Beispiele für jedes Muster sind in Abb. 3B zu sehen. Interessanterweise ist der Begriff der Genontologie (GO) (Astrozytenentwicklung) der oberste Begriff, der an Genen mit dem Up-Muster angereichert ist. Studien haben gezeigt, dass Glukose die morphologischen Funktionen von Astrozyten stark kontrolliert27, was auf einen direkten oder indirekten Einfluss der Hyperglykämie auf transkriptomische Veränderungen des Netzhautgefäßsystems schließen lässt. Die herunterregulierten Gene (die negativ mit der azellulären Kapillardichte korrelieren) sind mit DNA und zellulären Reparatur-/Reaktionsfunktionen angereichert, wie z. B. der Reparatur von Quervernetzungen zwischen Strängen. Es ist bekannt, dass die Makuladegeneration (eine lichtempfindliche Schicht in der Mitte der Netzhaut) eng mit einer Beeinträchtigung der DNA-Schädigung und des Reparaturmechanismus der Netzhaut verbunden ist28,29, die durch die Empfindlichkeit des retinalen Pigmentepithels (RPE) gegenüber Blau und Blau gekennzeichnet ist Belichtung mit UV-Licht. Interessanterweise wird der beeinträchtigte Mechanismus zur Reparatur von DNA-Schäden sowohl bei Makuladegeneration als auch bei früher Retinopathie beobachtet. Die Up-Down- und Down-Up-Muster sind mit einer Vielzahl biologischer Funktionen verbunden (siehe Ergänzungstabelle 2), wie z. B. der Elektronentransportkette (Up-Down-Muster) und der Regulierung der Neuronenreifungsmuster (Down-Up), was darauf hinweist Komplexität dynamischer transkriptomischer Veränderungen als Reaktion auf eine erhöhte azelluläre Kapillardichte. Die wichtigsten Begriffe der angereicherten Genontologie für jedes Muster sind in Abb. 3C dargestellt.

Unterschiedliche Genexpressionsmuster sind mit einer erhöhten azellulären Kapillardichte (ACD) verbunden. (A) Die segmentierte Regressionsanalyse identifizierte vier Muster (Up, Down, Up-Down und Down-Up), die mit einem erhöhten ACD mit einer False Discovery Rate (FDR) < 5 % verbunden sind; (B) Beispiele für jedes Muster; (C) Die drei wichtigsten Begriffe der angereicherten Genontologie (GO) für jedes Muster.

Wir nehmen an, dass die pathologischen Merkmale einer dysfunktionalen Netzhaut in ihren transkriptomischen Mustern kodiert sind. Somit können aus einer Kombination von Genexpressionsmustern subtile Veränderungen im Zusammenhang mit dem frühen Fortschreiten der diabetischen Retinopathie, quantifiziert durch die azelluläre Kapillardichte, abgeleitet werden. Um eine Mindestanzahl von Genen zu identifizieren, die zur Unterstellung der azellulären Kapillardichte verwendet werden können, entwickeln wir ein Random-Forest-Regressionsmodell (RFR). Wir haben die Genbedeutung basierend auf der Vorhersageleistung eingestuft, die sich durch den Permutationstest (dh permutierende Genexpressionsmuster für jedes Gen) ändert. Dann verwendeten wir eine Vorwärts-Feature-Selektionsmethode (dh das Hinzufügen jedes Gens nach dem anderen), um eine Mindestanzahl von Genen auszuwählen, die die beste Leistung erzielen können (siehe Methoden). Wie in Abb. 4A gezeigt, haben wir eine Kombination von 14 Genen identifiziert, die die azelluläre Kapillardichte mit hoher Genauigkeit vorhersagen kann (Pearson-Korrelationskoeffizient R = 0,91; Abb. 4B). Dies deutet darauf hin, dass die azelluläre Kapillardichte eindeutig in den Genexpressionsmustern dieser 14 Gene kodiert ist und ein maschinelles Lernregressionsmodell die transkriptomischen Signale entschlüsseln kann, die mit diesem frühen Retinopathiemerkmal verbunden sind.

Random-Forest-Regressionsmodell zur Vorhersage der Dichte azellulärer Kapillaren. (A) Das Random-Forest-Regressionsmodell identifizierte eine Kombination von 14 Genen, die die Dichte azellulärer Kapillaren quantitativ vorhersagen können. (B) Die vorhergesagte azelluläre Kapillardichte korreliert stark mit der beobachteten azellulären Kapillardichte.

Derzeit gibt es keine wirksamen Möglichkeiten, eine frühe Retinopathie zu behandeln oder umzukehren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Umkehrung der Expressionsmuster von Krankheitsgenen gut mit der Arzneimittelwirksamkeit korreliert und therapeutische Ziele aufzeigt30. Insbesondere wenn ein kleines Molekül oder eine Verbindung die Genexpressionsmuster von Krankheitsmarkern ganz oder teilweise umkehren kann, kann es sich um ein potenzielles Medikament zur Behandlung von Krankheiten handeln. Angesichts der Tatsache, dass eine erhöhte azelluläre Kapillardichte eines der frühesten quantitativen Merkmale der diabetischen Retinopathie ist, nehmen wir an, dass eine Verbindung, wenn sie das mit der azellulären Kapillardichte assoziierte Transkriptom ganz oder teilweise umkehren kann, ein potenzieller Medikamentenkandidat sein könnte, der das Fortschreiten des Sehverlusts verändert . Zu diesem Zweck identifizierten wir mithilfe der Rangkorrelationsanalyse nach Spearman (absoluter Korrelationskoeffizient (Rho) > 0,4; Abb. 5) Gene, die positiv oder negativ mit den azellulären Kapillardichteniveaus korrelieren. Absolute Rho-Werte über 0,4 weisen im Allgemeinen korrelierte Muster auf31. Anschließend durchsuchten wir die LINCS L1000-Datenbank zur Störung der Genexpression chemischer Verbindungen32, um Medikamente zu finden, die dieses Muster möglicherweise umkehren könnten (d. h. eine Verbindung, die die Genexpression für positiv korrelierte Gene mit azellulärer Kapillardichte herunterregulieren und gleichzeitig die Genexpression für azelluläre Kapillaren hochregulieren kann). Dichte negativ korrelierter Gene). Wir fanden heraus, dass NVP-TAE684, Geldanamycin und NVP-AUY922 die drei wichtigsten Verbindungen sind, die möglicherweise den retinalen Gefäßphänotyp, der mit einer hohen azellulären Kapillardichte einhergeht, umkehren können (Abb. 5). NVP-TAE684 ist ein Inhibitor der anaplastischen Lymphomkinase (ALK). ALK ist eine Rezeptortyrosinkinase, die zur Insulinrezeptor-Superfamilie gehört und einen hohen Grad an Homologie mit der Leukozytentyrosinkinase (LTK) aufweist33. Sowohl Geldanamycin als auch NVP-AUY922 sind Hsp90-Inhibitoren11,12. Interessanterweise haben Studien gezeigt, dass eine kurzzeitige Behandlung mit Hsp90-Inhibitor eine Stressreaktion der Netzhaut mit molekularer Chaperon-Expression stimulieren und so eine Netzhautdegeneration in Modellen für Retinitis pigmentosa und altersbedingte Makuladegeneration verhindern kann13. Obwohl keine Studie zeigt, dass Hsp90-Inhibitoren zur Behandlung früher Retinopathie eingesetzt werden können, gibt es Hinweise darauf, dass Hsp90-Inhibitoren wie AUY922 mikrovaskuläre Endothelzellen schützen und reparieren können, die mit einer Funktionsstörung der Endothelbarriere in einem anderen biologischen Kontext (z. B. menschliche Lunge) zusammenhängen34). Die endotheliale Dysfunktion der Netzhaut ist eine erhebliche Komplikation, die diabetische Retinopathie auslöst35,36. Daher ist es wahrscheinlich, dass Hsp90-Inhibitoren (Geldanamycin und NVP-AUY922) möglicherweise eine frühe Retinopathie behandeln oder schützen können, indem sie mikrovaskuläre Endothelzellen modulieren.

Identifizierung mutmaßlicher Kandidaten, die die azelluläre Kapillardichte über das Reverse Transkriptom reduzieren können. Die Heatmap zeigt Gene mit |Rho|> 0,4 ​​zwischen Genexpressionswerten und azellulärer Kapillardichte (ACD). Bei der Suche in der LINCS L1000-Datenbank zur gestörten Genexpression chemischer Verbindungen wurden NVP-TAE684, Geldanamycin und NVP-AUY922 als die drei besten Kandidaten identifiziert.

Um unsere vorhergesagten Medikamente weiter zu bewerten, führten wir einen Text-Mining-Ansatz durch. Wir haben eine Reihe von Retinopathie-assoziierten anatomischen Merkmalen aufgelistet: Mikroaneurysma, Perizytenverlust, Punktblutungen, intraretinale Blutungen, harte Exsudate, Watteflecken, Neovaskularisation, venöse Perlenbildung, Ischämie. Anschließend haben wir ein Text-Mining-Tool (KinderMiner: https://www.kinderminer.org/login) verwendet, um zu berechnen, ob die vorhergesagten Verbindungen (NVP-TAE684, Geldanamycin und NVP-AUY922) in einer der mit Retinopathie assoziierten anatomischen Merkmale statistisch angereichert sind (siehe oben aufgeführte Funktionen durch Scannen von 34.006.217 PubMed-Artikeln). Wir fanden heraus, dass Geldanamycin im „Neovaskularisationsterm“ (P-Wert = 0,001) und im „Ischämie“-Term (P-Wert = 8,7E-10) statistisch angereichert ist. Da sowohl Geldanamycin als auch NVP-AUY922 Hsp90-Inhibitoren sind, haben wir die Anreicherungs-P-Werte des Begriffs „Hsp90-Inhibitoren“ in Retinopathie-assoziierten anatomischen Merkmalen basierend auf dem KinderMiner-Tool weiter berechnet. Der Begriff „Hsp90-Inhibitoren“ ist statistisch angereichert mit dem Begriff „Neovaskularisation“ (P-Wert = 0,02) und dem Begriff „Ischämie“ (P-Wert = 6,6E-5). Dies bestätigte indirekt, dass unsere vorhergesagten Hsp90-Inhibitoren (Geldanamycin und NVP-AUY922) möglicherweise die prodromale diabetische Retinopathie abschwächen oder mildern könnten.

Diabetische Retinopathie ist eine fortschreitende Erkrankung, die schließlich zum Verlust der Sehkraft führt. Obwohl die aktuellen technologischen Fortschritte dazu geführt haben, dass eine frühe Retinopathie vor einer Sehbehinderung leicht erkannt werden kann, fehlen Strategien zur Behandlung einer frühen Retinopathie und zur Vorbeugung von Sehverlust. Menschliches Gewebe mit früher Retinopathie ist kaum verfügbar. Daher sind Tiermodelle erforderlich. Diabetische Nilratten entwickeln Netzhautläsionen, die der diabetischen Retinopathie beim Menschen ähneln und mit Sehverlust einhergehen9, die auf gemeinsamen molekularen Mechanismen beruhen können.

In unserer vorherigen Studie haben wir herausgefunden, dass die azelluläre Kapillardichte zumindest im Nilrattenmodell ein quantitatives Merkmal ist, das mit Risikofaktoren für diabetische Retinopathie assoziiert ist. Die azelluläre Kapillardichte ist bei der Nilratte im Vergleich zu anderen vaskulären charakteristischen Veränderungen wie Perizytenverlust (kleiner Dynamikbereich) und neuronalen Läsionen (später erkennbar) früher mit einem großen dynamischen Bereich erkennbar. Wir nehmen an, dass molekulare Signaturen, die eine frühe Retinopathie auslösen, im Netzhautgefäßsystem kodiert sind und daher auch mit der azellulären Kapillardichte verbunden sind. Wir haben ein maschinelles Lernmodell über Genexpressionsmuster von vierzehn Genen entwickelt, das die azelluläre Kapillardichte quantitativ vorhersagen kann. Da die azelluläre Kapillardichte ein quantitatives Merkmal ist, das mit der frühen diabetischen Retinopathie assoziiert ist, kann unser Modell als „transkriptomische Uhr“ für das frühe Fortschreiten der Retinopathie verwendet werden, die den Schweregrad oder das Fortschreiten der frühen Retinopathie misst. Wir erkennen jedoch an, dass dieses Modell auf Daten zur diabetischen Retinopathie von Nilratten basierte. Vergleiche mit anderen Tiermodellen und Menschen sind erforderlich, um das Genexpressionsmuster zu validieren und festzustellen, ob dieses Vorhersagemodell artenübergreifend konsistent ist.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Umkehrung der Expressionsmuster von Krankheitsgenen gut mit der Arzneimittelwirksamkeit korreliert30. Daher nehmen wir an, dass ein kleines Molekül oder ein Medikament, wenn es den Großteil oder einen signifikanten Teil der DR-bedingten Genexpressionsänderungen umkehren kann, ein mutmaßlicher Kandidat für ein DR-Behandlungsmedikament sein kann. Wir verwendeten azelluläre Kapillardichte-assoziierte hoch- und herunterregulierte Gensignaturen, um Arzneimittel zu identifizieren, die solche Muster möglicherweise umkehren oder teilweise umkehren können, indem wir die LINCS L1000-Datenbank für die gestörte Genexpression chemischer Verbindungen durchsuchten32. Die grundlegende Grundlage für diesen Ansatz geht davon aus, dass die gezielte Behandlung früher Gefäßveränderungen der Schlüssel zur Blockierung einer frühen Retinopathie ist. Diese Annahme basiert auf unserer früheren Studie, dass die erhöhte azelluläre Kapillardichte ein zuverlässiges quantitatives Merkmal war, das bei der anfänglichen Entwicklung einer Retinopathie vor einer zusätzlichen Gefäßdysfunktion in Perizyten und Endothelzellen vorhanden war9. Zu den drei am häufigsten vorhergesagten Medikamenten gehören Geldanamycin und NVP-AUY922 sowie Hsp90-Inhibitoren11,12. Einige Studien haben gezeigt, dass Hsp90-Inhibitoren mikrovaskuläre Endothelzellen schützen und reparieren können, die mit einer Funktionsstörung der Endothelbarriere in Zusammenhang stehen, jedoch in einem anderen biologischen Kontext: der menschlichen Lunge34. Obwohl wir in Zukunft weitere In-vivo-Studien benötigen, um unsere Ergebnisse zu untermauern, bieten wir einen datengesteuerten Ansatz zur Wiederverwendung von Behandlungsmedikamenten, der den traditionellen Weg der Arzneimittelentdeckung erheblich verkürzen kann. Wir erkennen jedoch auch an, dass In-vivo- und In-vitro-Studien erforderlich sind, um diese zweckentfremdeten Arzneimittel weiter zu validieren.

Unsere Studie liefert nicht nur transkriptomische Einblicke in die Pathogenese der Retinopathie im Frühstadium, sondern bietet auch einen neuartigen datengesteuerten Ansatz zur Priorisierung und Neuverwendung von Behandlungsmedikamenten.

Wir haben die RNA-seq-Daten und die Genexpressionsdaten (TPMs und Mapping-Zählungen) an GEO übermittelt (Zugangsnummer: GSE220672).

Diabetische Retinopathie

Bayesianisches Netzwerk

Zufälliger Blutzucker

Azelluläre Kapillardichte

Gen-Ontologie

Zufällige Waldregression

Ausgepackt

Pigmentepithel der Netzhaut

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Referenzen herunterladen

Wir danken Jennifer Bolin und Jessica Antosiewicz-Bourget für ihre technische Unterstützung (RNA-seq). Wir danken auch Xiujie Li für die Diskussion und die Vorschläge zu diesem Projekt. Wir danken dem Center for Gene Regulation in Health and Disease (GRHD) der Cleveland State University und Prof. Anton Komar für die Unterstützung.

Diese Studie wurde von der Garland Initiative for Vision unterstützt, finanziert von der William K. Bowes Jr. Foundation. Peng Jiang wird auch von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (D20AC00002) finanziert.

Neurowissenschaftliches Forschungsinstitut, University of California Santa Barbara, Santa Barbara, CA, USA

Huishi Toh, Alexander Smolentsev, Ryan Sadjadi, Dennis Clegg und James A. Thomson

Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie, University of California Santa Barbara, Santa Barbara, CA, USA

Dennis Clegg und James A. Thomson

Morgridge Institute For Research, Madison, WI, 53706, USA

Ron Stewart und James A. Thomson

Abteilung für Biologie, Geologie und Umweltwissenschaften, Cleveland State University, Cleveland, OH, 44115, USA

Jingqi Yan & Peng Jiang

Zentrum für Gene Regulation in Gesundheit und Krankheit, Cleveland State University, Cleveland, OH, 44115, USA

Jingqi Yan & Peng Jiang

Zentrum für RNA-Wissenschaft und -Therapeutik, School of Medicine, Case Western Reserve University, 10900 Euclid Avenue, Cleveland, OH, 44106, USA

Peng Jiang

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Nilrattenexperiment: HT, AS & RS (Ryan); Datenanalyse und Modellierung: PJ; Technischer und Laborsupport: DC, JY, RS (Ron); Manuskripterstellung: HT, PJ; Aufsicht: JAT & PJ

Korrespondenz mit Peng Jiang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Toh, H., Smolentsev, A., Sadjadi, R. et al. Die transkriptomische Uhr sagt Gefäßveränderungen bei prodromaler diabetischer Retinopathie voraus. Sci Rep 13, 12968 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40328-w

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Eingegangen: 31. März 2023

Angenommen: 08. August 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40328-w

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